Métode Colorimetry Jeung Colorimetry Ku ELISA

(1) rendering warna

ELISA kromogenik mangrupikeun léngkah terakhir dina réaksi inkubasi, dina waktos ieu énzim ngatalisan substrat anu teu warnaan pikeun ngahasilkeun produk berwarna. Suhu sareng waktos réaksi tetep janten faktor anu mangaruhan kamekaran warna. Dina kurun waktu nu tangtu, liang négatip bisa tetep teu warnaan, sarta liang positif jeung penyuluhan waktu jeung warna enhancement. Paningkatan suhu anu pas ngabantosan ngagancangkeun kamekaran warna. Dina tekad kuantitatif, suhu réaksi sareng waktos saatos nambihan substrat kedah akurat dumasar kana peraturan. Warna anu ditangtukeun sacara kualitatif tiasa dilaksanakeun dina suhu kamar, waktos umumna henteu kedah dikontrol sacara ketat, sakapeung dumasar kana kontrol anu positif sareng kontrol négatip ogé kaayaan warna tiasa cocog pikeun pondok atanapi manjangkeun waktos réaksi, kaputusan tepat waktu.

Ngembangkeun warna substrat OPD umumna henteu langkung jero saatos 20-30 menit réaksi dina suhu luar atanapi 37 derajat, teras waktos réaksi tiasa diperpanjang pikeun ningkatkeun nilai latar. Cairan substrat OPD bakal otomatis robih warna nalika kakeunaan cahaya. Réaksi warna kudu dilaksanakeun dina poék. Nalika réaksi warna réngsé, leyuran terminasi ditambahkeun pikeun ngeureunkeun réaksi. Saatos produk OPD ditungtungan ku asam sulfat, warnana robih tina koneng oranyeu janten koneng coklat.

TMB henteu kapangaruhan ku cahaya sareng tiasa disimpen dina méja operasi dina suhu kamar pikeun niténan hasilna ku réaksi samping. Nanging, pikeun mastikeun stabilitas hasil ékspérimén, disarankeun maca hasil dina waktos anu pas. Saatos perlakuan HRP, warna TMB ngahontal ngeunaan 40 menit, lajeng laun ngaruksak, sarta lengkep luntur kana warnaan sanggeus 2 jam. TMB terminates dina rupa-rupa solusi. Inhibitor énzim sapertos natrium azida sareng natrium dodesil sulfat (SDS) tiasa ngeureunkeun réaksina. jenis ieu terminator ogé bisa nyieun warna biru ngajaga pikeun lila (12-24 jam), mangrupakeun terminator alus keur judgment visual. Sajaba ti éta, rupa-rupa terminator asam bakal ngarobah bulao jadi konéng, nalika panjang gelombang husus (450nm) bisa dipaké pikeun maca nilai nyerep.

(2) kolorimétri

Sateuacan colorimetry, kertas absorbent bersih kudu dipaké pikeun garing cairan napel handap piring, lajeng piring kudu leres ditempatkeun dina pigura colorimetric tina énzim colorimeter baku. Dina tés nganggo pelat lemes salaku pamawa, piring kedah disimpen dina pigura 96-liang standar sateuacan ngabandingkeun warna tiasa dilaksanakeun. Sateuacan nambahkeun solusi substrat pikeun warna, motong ujung piring lemes beresih, ku kituna piring bisa sagemblengna seated dina pigura korsi.

Nalika colorimetry, titik enol kudu disaluyukeun jeung cai sulingan heula, sarta liang substrat (liang kalawan solusi substrat ditambahkeun tanpa réaksi nanaon) jeung liang kosong (liang kalawan saline normal atawa diluent tinimbang specimen salaku sakabeh proses) kudu diukur sarta maca pikeun ngarekam status réagen test ieu. Lajeng liang kosong bisa dipaké pikeun calibrate titik enol jeung cai sulingan, sarta absorbance tina liang luhur kudu dikurangan ti absorbance tina liang kosong, lajeng diitung.

Ekspresi tina hasil kolorimétri nyaéta kapadetan oplikal (OD) dina jaman baheula, tapi nyerep (A) dianggo dumasar kana peraturan, anu ngagaduhan harti anu sami. Metodeu éksprési anu biasa nyaéta nyerat panjang gelombang nyerep di pojok katuhu handap hurup A. Contona, panjang gelombang nyerep OPD nyaéta 492nm, sareng metode éksprési nyaéta "A492nm" atanapi "OD492nm".

(3) énzim colorimeter baku

Kolorimétri standar énzim disebut alat standar énzim, biasana ngarujuk kana fotométer pikeun ngukur nyerep hasil ELISA. Numutkeun kana rupa-rupa pamawa padet, aya desain khusus pikeun piring, manik sareng tabung uji leutik. Seueur perusahaan réagen nyayogikeun alat labél énzim anu cocog. Indéks kinerja utama alat pelat énzim nyaéta: laju maca, akurasi maca, kabisaulangan, gelar sareng rentang anu tiasa diukur, linieritas sareng saterasna. Bacaan microplate méter anu saé umumna 0,001, kalayan akurasi ± 1% sareng kaulangan dugi ka 0,5%. Contona, upami nilai A tina A liang nyaeta 1,083, mangka nilai A sabenerna liang relatif ka hawa kedah 1,083 ± 0,01 (1,073 ~ 1,093). Pangukuran diulang sababaraha kali, nilai A kedah 1.083 ± 0.05 (1.078 ~ 1.088). Kisaran pangukuran analis piring énzim beda-beda dumasar kana kinerja analis piring énzim. Watesan énzim pelat analyzer umum nyaéta 0.000 ~ 2.000, tapi wates énzim plat analyzer anyar ieu widened ka 2.900, atawa malah leuwih luhur. Nilai anu ngaleuwihan wates luhur pangukuran sering dituduhkeun ku "*" atanapi "leuwih" atanapi simbol anu sanés. Perhatosan kedah diperhatoskeun kana bédana antara rentang anu tiasa diukur sareng rentang linier. Kisaran linier sering langkung handap tina rentang anu tiasa diukur. Contona, rentang ukuran tina instrumen plat énzim tangtu nyaéta 0.000 ~ 2.900, bari rentang linier na ngan 0.000 ~ 2.000, nu kudu nengetan nalika nyieun kurva baku dina ELISA kuantitatif.

Alat labél énzim henteu kedah disimpen dina sinar panonpoé atanapi sinar panonpoé anu kuat. Suhu kamar kedah 15-30 derajat salami operasi. Alatna kedah dipanaskeun 15 dugi ka 30 menit sateuacan dianggo, supados hasil bacaan langkung stabil.

Nalika ngukur nilai A, puncak nyerep sénsitip produk kedah dipilih. Contona, OPD ngagunakeun panjang gelombang 492nm. Kahiji kalina dina panjang gelombang optimum (W1) jeung kadua kalina dina panjang gelombang teu peka (W2). Posisi plat ELISA teu dipindahkeun antara dua ukuran. Salaku conto, OPD ngagunakeun 492nm salaku W1 sareng 630nm salaku W2, sareng nilai ahir anu diukur nyaéta bédana antara dua (W1-W2). Bacaan panjang gelombang ganda tiasa ngirangan gangguan cahaya anu disababkeun ku goresan atanapi tanda ramo dina wadahna.